摘要

目的：研究枫糖尿病的临床症状，揭示其发病的遗传原因。

方法:采用靶向捕获测序法筛选患者的突变。对患者的父亲、母亲和姐姐的样本进行了实时PCR，对1、5、9号外显子进行了CNV分析。行全基因组测序，定位大段缺失的断点的大致位置。行Long-range PCR和Sanger测序，以识别缺失的长度并定位断裂位点。

结果：病人在BCKDHA基因上有复合杂合变异，包括一个小缺失(c.1227_1229del chr19: 41930402) 和一个新型的涉及1-9号外显子的大段缺失。大段缺失的连接位点定位在两个Alu元件的微同源序列中。

结论：本研究是对引发MUSD（枫糖尿病）的由Alu元件介导的BCKDHA重排序列的首次报道。该结果可能拓展对MSUD的发生和致病原理的了解，益于日后的遗传咨询与遗传检测。

1. 介绍

MUSD（枫糖尿病）是一种罕见的影响BCAAs（支链氨基酸）代谢的常染色体隐性遗传疾病。MSUD是由于支链a-酮酸脱氢酶复合物（BCKDC）的活性缺陷造成的。BCKDC包括三个催化组分，即支链酮酸脱羧酶(由两个E1α亚基和两个E1β亚基组成)、二氢硫辛酰胺转酰化酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E)，分别由BCKDHA、BCKDHB、DBT和DLD基因编码。已在DBT、BCKDHB和BCKDHA基因中发现MSUD的致病突变。

当BCKDC的活性降低时，各BCAAs及其α酮酸在血浆中积累，引发致渐有害的临床后果。由于α酮酸积累的结果，MSUD患者尿液中有一种近似焦糖或枫糖浆的特征气味。MSUD患者的临床表现包括精神运动迟缓、进食不良、发育迟缓、癫痫发作、嗜睡、昏迷甚至死亡。根据临床表现、发病年龄和持续的BCKDC活性，MSUD可分为五种形式(E3缺乏型、间歇型、中间型、经典型和像中间型的硫胺素反应型）。其中，经典型是最常见的类型，特征表现为常规酶活性<2%，75%左右的严重临床症状发生在出生后几天，预后不良。

在本次研究中，我们描述了一例由小缺失突变(C.1227_1229del chr19：41930402)和BCKDHA基因中的一个新型大段缺失突变引发严重经典型MSUD的中国病人。缺失的连接位点定位在两个Alu元件的微同源序列中。 因此，我们推测Alu/Alu介导的重排是引发大段缺失的突变事件。   

2. 方法与材料

  2.2病人描述

本研究报告的病例是一名女性新生儿。病人的父母和姐姐都是健康的，非近亲结婚。

  2.3靶向捕获测序和分析

我们通过靶向捕获测序来筛选病人的突变。共选择了650个与遗传性代谢紊乱相关的基因，并使用定制的外显子富集试剂盒捕获了它们的编码区域。我们从先证者中精确地利用15μgDNA生成了HiSeq2500测序仪的索引库。产生的平均外显子覆盖率和变异的准确性大于99%。

用IlluminaHiSeq2500获得原始短序列。去除测序数据中接头和低质量数据。用SOAP比对软件定位短序列到相应的人类基因组数据中。测序结果包括分析了短序列的数量、目标区域的覆盖大小、平均测序深度等。用SOAPsnp鉴定基因型目标区域的位点。用GATK软件查找序列中的插入或缺失信息(InDel)。

输入单个样本的每个捕获目标区域的文件区域计数reads。 将同一批样本（与芯片混合）的区域计数合并，并计算每个区域所有样本的reads及总和。对于每个区域，计算每个样本的reads数和所有样本总和的比值。要输出所需的样本，重点是基因所覆盖区域的最终比率（可以通过柱状图展示）。在正常情况下（二倍体）的最终比例估计为1。 <0.55表示可能丢失，>1.35表示可能重复。

  

2.5 全基因组测序(WGS)和分析

由于病人已经去世，没有办法得到足够的样本。该大段缺失遗传自患者的父亲。我们收集了父亲的样本作进一步的分析。从父亲的外周血单核细胞中提取基因组DNA。用Covaris声波仪将纯化的DNA剪切成400-500bp的片段。用TruSeq DNA Nano Library Prep Kit (Illumina)制备了WGS文库。在Illumina NovaSeq6000仪器上分析了WGS库，该仪器产生了2×150bp的配对端reads，平均覆盖深度至少为×30。使用内部分析流程处理WGS数据。简单地说，使用BWA-0.7.5a将reads定位到hg19人类参考基因组。用PicardMarkDuplicates去除重复reads。用ClinSV分析WGS数据的结构变异(SVs)，通过断裂的reads、不一致的reads对和覆盖深度的证据，获得罕见的、高置信度的结构。

  2.7 silica分析中的蛋白质结构

从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，UniProt数据库(http://www.uniprot.org/) 和PDB数据库(http://www.rcsb.org),  获得了不同物种BCKDHA蛋白质的FASTA序列和三级结构。用Mafft7.450和Jalview2.11进行多序列比对、保守性分析和处理。用Swiss model预测突变后的蛋白质结构,使用PyMOL2.3.4来可视化蛋白质结构。

3. 结果

3.1 临床特征及实验室检查

 患者有正常的出生体重2.9kg。在第四天出现特征性表现，包括喂养不良、间歇性抽搐、低血糖。脑磁共振成像(MRI)报告显示在小脑半球、内囊后肢、脑干、小脑脚和大脑脚(图1)呈现高弥散加权成像(DWI) 信号。代谢筛查结果显示病人的血浆亮氨酸和缬氨酸水平分别为1787.3μM(正常值为53-284μM)和1129.7μM(正常值为46-256μM)。通过GC-MS分析，检测到尿中乳酸、α酮异戊酸、α酮异己酸和α-酮-β-甲基戊酸水平上升。根据生化数据和呈现的临床表现，患者MUSD分类为经典型。该患者在出生后第二十三天去世。

3.2 靶向捕获测序和实时PCR

靶向捕获测序用于检测患者的突变。采用Sanger测序和实时PCR对突变进行验证。我们报告发现先证者在BCKDHA基因上有一个来自母亲的小缺失突变(C.1227_1229del chr19：41930402)和来自父亲的1-9号外显子的大段缺失(图2, 3)。小缺失突变(c.1227_1229del chr19：41930402)位于BCKDHA基因9号外显子。

 

图 2. 通过靶向捕获测序、Sanger测序鉴定突变。 (a，b，c，d)结果显示先证者从母亲遗传了一个在BCKDHA基因上小的缺失突变(C.1227_1229delchr19：41930402)。患者BCKDHA基因1-9号外显子的拷贝数比正常对照低1倍（e）

 

图  3. 使用实时PCR对患者父亲、母亲和姐姐的样本进行第1、5、9号外显子CNV分析。根据缺失片段与内参基因(GAPDH)拷贝数的比例确定拷贝数变异。 y坐标上的数字指的是缺失区域与GAPDH拷贝数的比率。一般情况下，正常拷贝数为0.7 < 2-ΔΔCt<1.3，杂合度缺失异常拷贝数为0.3 < 2-ΔΔCt < 0.6(a，b，c)

3.3 行WGS分析和long-rangePCR

WGS分析显示，父亲中存在45598bp(chr19：41896116-41941714)的大段缺失(图4a)。在UCSC网站上查询到断点附近的碱基序列，如图4b所示，灰色部分是缺失的碱基，断裂点两侧的Alu序列分别为Alu Sq2和Alu Jr。为了进一步表征大段缺失的连接位点，行long-range PCR，PC R产物做琼脂糖凝胶电泳，发现正常对照标本中未扩增出目标片段，而在父亲的标本中扩增出目标片段(图5a)。通过Sanger测序获得断裂点附近的序列(图5c)，然后在NCBI网站上进行blast比对，进一步确认断点的位置(chr19：41896093-41941721)(图5b)。

 

图 4. 全基因组测序证实了BCKDHA基因的缺失。空白表示减少的测序深度和大段缺失的位置。红色箭头表示断点，在附近可以看到红色的断裂reads(a)。在UCSC网站查询到断点附近的碱基序列，灰色部分是缺失的碱基。UCSC网站显示，断裂点两侧的Alu序列分别为AluSq2和AluJr。缺失周围的微同源序列显示在黄色框中(b)

3.4 silica分析中的蛋白质结构

  BCKDHA基因9号外显子上的小缺失突变(c.1227_1229del chr19：41930402)导致BCKDHA多肽链中409和410位的苯丙氨酸和丝氨酸的缺失，代之以亮氨酸的插入。409和410位置上的苯丙氨酸和丝氨酸在不同物种间进化高度保守(图6)。进一步silica分析，构建E1组分(E1⍺，白色；E1β，橙色)复合物的三维蛋白质结构模型(图7)。野生型蛋白质与天冬酰胺、亮氨酸、精氨酸形成四个极性接触，而突变的亮氨酸只与亮氨酸形成一种极性接触，这可能会干扰E1⍺结构的稳定性。

 

图 7. 三维蛋白结构的E1组分复合物和结构说明突变。 三维蛋白结构的E1组分(E1⍺，白色；E1β，橙色)复合物。野生型(A)和突变残基(B)显示为树枝状，并着色（绿色；红色)。目标残基的极性接触显示为黄色虚线。野生型蛋白与天冬酰胺、亮氨酸、精氨酸形成四个极性接触。突变型与亮氨酸有一个接触，丢失与精氨酸的两个极性接触、与天冬酰胺的一个极性接触

4. 讨论

根据临床表现、发病年龄及持续的BCKDC活性，MUSD被分为五种类型(E3缺乏型、间歇型、中间型、经典型和像中间型的硫胺素反应型）。大多数报告表明，大部分MSUD患者表现为经典型。本次报告的病例也被归类为经典型的MSUD。该患者在出生后第四天出现特征性表现，包括喂养不良、间歇性抽搐、低血糖。患者血浆亮氨酸和缬氨酸水平分别为1787.3μM(正常53-284μM)和1129.7μM(正常46-256μM)。尿中支链氨基酸代谢产物的增多进一步证实了该诊断。作为一种在早期发现细胞毒性脑水肿的技术方法，与常规MRI相比，在急性期MUSD相关脑组织病变中显示MSUD水肿高信号方面，DWI有更高的灵敏度。在本次报告的病例中，DWI显示小脑半球、内囊后肢、脑干、小脑脚和大脑脚的标志性高信号。这与以前的研究是一致。

虽然已经确定了许多MSUD相关的分子病因，包括缺失、插入、错义和无义替换，但DBT、BCKDHB和BCKDHA基因的大片段缺失，目前只证实了几个。在MSUD患者中，DBT基因内已确定了四个大片段缺失。在一名伊朗病人和两名中国病人发现了BCKDHB基因的三个缺失变异。

对于BCKDHA，已经报告了三个大片段缺失，一个来自西班牙患者的6号外显子跳跃，一个来自葡萄牙患者的2-4号外显子纯合缺失，一个来自中国患者的6-8号外显子杂合缺失。 然而，这些缺失的原因尚未得到很好的描述，断裂位点还不明确。本研究描述了BCKDHA基因的45598bp缺失(chr19：41896116-41941714)。对连接片段的分析表明，近端和远端断点位点有两个Alu元件(AluSq2和AluJr)。缺失片段周围的微同源序列包含29个碱基。缺失断点连接的表征表明，断点发生在ALU重复序列中，缺失最有可能是由微同源事件介导的。

Alu重复序列占人类基因组的11%，每个单倍体基因组都有100多万份拷贝的Alu序列。据估计，不论类型、反复或非反复重排，0.3%的人类遗传疾病都有Alu/Alu介导的基因组重排的参与。在这些遗传病中，一些疾病是由于基因缺陷导致酶功能障碍引起，例如：糖原储累积症II型、X-连锁肝糖原病、Lesch-Nyhan综合征、血友病等等。MSUD也是由BCKDC功能受损引起的常染色体隐性疾病。2018年，报道了一例在中国MSUD患者发现的由Alu介导的非等位基因重组引起BCKDHB全基因缺失。本研究是首次报道由Alu元件介导的BCKDHA序列重排引发MSUD。

不同的Alu亚家族，如AluJ、AluSx和AluSq、AluYa和AluYb，与Alu一致序列的同源性达70-80% 。当一对Alus介导基因组重排(AAMR)时，在交界处会形成嵌合的Alu序列。我们的研究发现两个不同Alu元件(AluSq2和AluJr) 共有一段29bp的微同源序列，在接合处形成一个新的嵌合的Alu元件。

小缺失突变(c.1227_1229del chr19：41930402)位于BCKDHA基因第9外显子。2016年曾 报道过这个突变。该变异会导致BCKDHA多肽链上第409和410位上的苯丙氨酸和丝氨酸缺失，代之以一个亮氨酸的插入。在BCKDHA多肽链中，第409和410位上的苯丙氨酸和丝氨酸在不同物种之间高度保守(图 6），如猴子、雪貂、兔子、老鼠等。这意味着这些位点在我们的人体中起着至关重要的作用，如果残基发生变化，会带来有害影响。在本研究中，野生型蛋白与天冬酰胺、亮氨酸、精氨酸形成四个极性接触，而突变型中的亮氨酸只与亮氨酸形成一个极性接触，这可能会干扰E1⍺结构的稳定性。我们推测这种变化对BCKDC的功能有负面影响。

5. 结论

    在此，我们描述了MSUD患者的复合杂合的BCKDHA突变，包括小缺失突变(c.1227_1229del chr19：41930402)和包含整个BCKDHA基因的大段缺失。对接合片段的分析表明，在近端和远端断点位点上分布两个Alu元件(AluSq2和AluJr)。这一发现表明，BCKDHA基因中的新型大段缺失似乎是通过Alu/Alu介导的重排造成的。本研究是对引发MSUD的由Alu元件介导的BCKDHA重排序列的首次报道。我们的研究结果可能拓展对MSUD的发生和致病原理的了解，益于日后的遗传咨询与遗传检测。