山东大学赵涵教授及陈子江院士共同通讯在Cell Research 在线发表题为“Dominant mutations in CHK1 cause pronuclear fusion failure and zygote arrest that can berescued by CHK1 inhibitor”的研究论文，山东大学张鸿惠博士、上海交通大学陈泰来博士、山东大学吴克良教授、侯真真助理研究员为本文共同第一作者。该研究确定了CHK1的新型显性遗传突变，这些突变导致合子阻滞引起的女性不育，其特征是雌雄原核融合失败。 该研究还证明了由突变引起的CHK1活性增加可以阻止受精卵的G2 / M过渡。 重要的是，使用CHK1抑制剂抑制其激酶活性可以挽救小鼠和人类的合子阻滞表型，为治疗这种类型的不育症提供了有效而安全的干预措施。

文章介绍

进化上高度保守的DNA损伤反应（DDR）与细胞周期检查点保证了基因组的稳定性，在其中起到关键作用的蛋白激酶是细胞周期检查点激酶1（CHK1）。CHK1最是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控着细胞周期的G2/M期转换。当基因组受损或者DNA复制受阻时，CHK1第345位丝氨酸磷酸化后被激活，发挥DNA损伤检查点与复制检查点的功能。CHK1在哺乳动物早期胚胎发育过程中有重要作用，最近研究表明，抑制CHK1活性可加速小鼠第一次卵裂的细胞周期进程。尽管Chk1在小鼠早期胚胎发育中有重要作用，其在人类早期胚胎发育尤其是第一次卵裂中的作用未有研究。

本项研究利用全外显子测序技术（WES）对伴有受精卵分裂障碍的女性受限型不孕症患者进行分析，在四个独立家系中发现了四个CHK1基因（MIM:603078; GenBank: NM_001274.5）的杂合致病突变，并对其致病机制与干预方法进行了探索。

CHK1致病突变的发现

临床上有这样一类患者，其受精卵绝大多数阻滞在一细胞阶段，并且伴有明显的原核融合障碍（PFF-ZA，表1）。我们家系１中先证者(III-2)与两位可育女性(II-1 和 II-3)进行全外显子测序分析，经过一系列过滤筛选后，我们发现了ＣＨＫ１　罕见的常染色体显性杂合致病突变c. 1136 G>A（p.R379Q）；结合Sanger测序验证，我们发现该家系中另两位不孕患者（II-4 和 III-1）亦有该突变。该突变与不孕状态共分离且有父性传递的特征，即患者突变等位基因来自父亲，母亲不携带此突变（图1）。

图1 四个PFF-ZA家系中发现CHK1显性突变

为进一步验证CHK1突变与受精卵阻滞表型之间的关系，我们对本中心主要表现为受精卵阻滞的原发性不孕症患者进行WES 或者Sanger测序，并分别在家系２中II-1、家系３中II-2、家系4中II-1与II-2发现了三个ＣＨＫ１杂合突变：缺失突变c.1323delC（p.F441fs*16）、错义突变c. 1325 G>A（p.R442Q）与错义突变c. 1259 G>A(p. R420K)，其中家系2与家系3中两位患者的父母均无ＣＨＫ１　突变，说明这两个突变为新发突变（图1）。这四个CHK1突变在常见公共数据库中未见报导。三个错义突变通过ＳＩＦＴ、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｔａｓｔｅｒ预测会影响CHK1蛋白的功能，且ACMG评分均为可能致病。

 表1 患者临床特征

CHK1激活突变通过CDC25C/CDK1通路引起受精卵G2/M转换阻滞

进一步研究发现，CHK1在受精卵阶段以及受精前后阶段相对高表达，表明其在受精卵阶段可能发挥重要作用。研究人员将这4个人类CHK1突变体显微注射至小鼠受精卵后发现，小鼠受精卵也发生雌雄原核融合受阻、不能卵裂，完全重复了人类PFF-ZA的表型。

CHK1蛋白的N端是高度保守的激酶结构域，C端为调节结构域，包含两个保守基序（CM1与CM2）。既往研究表明，CM1与CM2内的某些突变可以改变CHK1蛋白构象，导致其激酶活性增高。有趣的是，这4个CHK1有害突变分别位于C端的CM1和CM2内或附近（图2）。体外实验显示突变后蛋白在胞内的定位改变，蛋白结构预测表明突变改变与周围氨基酸残基间的氢键与蛋白的表面电势，进一步的体外激酶活性检测表明突变后CHK1激酶活性增强。已有研究提示，激活后的CHK1可通过磷酸化下游CDC25C导致抑制性CDK1积聚，进而引起细胞周期G2/M期转换阻滞。与之一致的是，突变CHK1可导致抑制性磷酸化的CDC25C(S216)与CDK1(T14&Y15）表达增多，尤其以截短突变（p.F441fs*16）最为显著；并且将CDC25C与CDK1的关键磷酸化位点突变后，可显著提高携带突变受精卵的卵裂率，表明CHK1激活突变通过CDC25C/CDK1通路导致受精卵G2/M期转换阻滞，引发卵裂障碍。

图2 CHK1蛋白结构与突变位置示意图

CHK1抑制剂为该类不孕症患者的治疗带来福音

目前，绝大多数卵裂障碍患者的病因仍不明晰，亦缺乏有效的治疗手段，探索切实可行的治疗方案将为该类患者与其家庭带来福音。CHK1抑制剂广泛报道到与多种抗癌药物联合应用用于增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。鉴于CHK1突变蛋白的激酶活性增高，研究人员选择了一种ATP竞争性的CHK1抑制剂（PF477736）进行体外挽救实验，该抑制剂目前已有一期临床试验，与吉西他滨联合应用治疗肿瘤。体外实验表明合适浓度的PF477736可通过降低CHK1下游磷酸化CDC25C与CDK1的水平显著提高突变小鼠受精卵的卵裂率与囊胚形成率并可获得健康小鼠后代。有幸的是，患者捐赠科研的受精卵应用CHK1抑制剂处理后可发育形成囊胚（图3）。进一步研究发现，这些囊胚来源的胚胎干细胞具有全能性并且保持了基因组的完整性。

图3 应用CHK1抑制剂PF477736可使患者受精卵发育至囊胚

小结

本研究发现CHK1C末端保守结构域内的显性突变可导致原核融合失败与受精卵发育阻滞（PFF-ZA），并阐明了突变引起的CHK1激酶活性增加阻碍了受精卵的G2/M转换。重要的是，使用CHK1抑制剂抑制其激酶活性可以有效挽救小鼠和人类的受精卵阻滞表型，为此类不孕症患者的治疗提供有效和安全的干预措施。