背景
醚脂类是一类特殊的脂类，其特征为在甘油主链的sn-1位置有一个醚键而不是酯键（图1a）。醚脂类又可细分为中性脂类和磷脂。中性醚脂类的特征不明显，它们的功能在很大程度上是未知的。醚磷脂（图1）其包括缩醛磷脂并占人体磷脂的20%，存在于大多数组织的细胞膜中，在中枢神经系统、心脏、肾脏和白细胞中的水平特别高。缩醛磷脂原作为抗氧化剂和/或信号分子在膜动力学中发挥作用。它们与几种神经退行性病变如阿尔茨海默病和帕金森病致病机理有关，但它们在各种具有严重多系统表型的遗传性疾病中的重要性已被明确地证实，并且在这些疾病中，醚脂质的生物合成均受到损害。这些疾病包括五种不同类型的肢根性点状软骨发育不全（RCDP）和Zellweger谱疾病（ZSD），前者具有缩醛磷脂合成的原发性缺陷，后者由于过氧化物酶的生物发生缺陷而具有继发性缩醛磷脂缺乏。
醚(磷)脂类的生物合成是一个涉及不同的酶多步骤的过程；前三个步骤发生在过氧化物酶体中，随后的步骤发生在内质网中（图1b）。在在过氧化物酶体中合成1-酰基二羟基丙酮磷酸酯（1-酰基-DHAP）后，酰基单元被脂肪醇取代，从而形成1-烷基二羟基丙酮磷酸酯（1-烷基-DHAP）。用于该反应的脂肪醇由过氧化物酶体脂肪酰基-CoA还原酶1（FAR1）产生，其接受16和18个碳原子的饱和和（单）不饱和脂肪酰基-CoA作为底物，并使用NADPH作为辅因子将它们还原成相应的脂肪醇。然后1-烷基-DHAP在过氧化物酶体中还原成1-烷基甘油磷酸酯，并在内质网的几个步骤中进一步转化成醚磷脂（图1b）。
FAR1定位于过氧化物酶膜中，被认为是醚（磷酸）脂质生物合成中的限速酶。FAR1是由515个氨基酸组成的尾锚定蛋白，其N端结构域面向胞浆，对应1-465位氨基酸，跨膜结构域对应466-483位氨基酸，C端结构域位于过氧化物酶基质中，对应484-515位氨基酸。位于451-507氨基酸之间的区域是依赖于Pex19p的过氧化物酶靶向所需的。FAR1的活性通过响应于缩醛磷脂水平增加的活性蛋白的降解而在蛋白水平上调节。因此，在具有缩醛磷脂缺乏的细胞系中，FAR1蛋白水平和活性升高，而向这些细胞外源补充缩醛磷脂（或其前体）可导致FAR1蛋白水平正常化。这种反馈调节机制中对缩醛磷脂水平的感知被认为是发生在质膜的内叶中，但确切的机制仍是个谜。
FAR1缺乏（也称为RCDP 4型，MIM 616154）已在极少数个体中被描述，是一种常染色体隐性遗传疾病，临床表现为智力残疾、先天性白内障、发育迟缓和癫痫。不存在在其他类型的RCDP（1-3型RCDP分别由PEX7 [MIM 215100]、DHAPAT [MIM222765和AGPS [MIM 600121]的缺陷引起）中看到的肢根和骨胳变化。与其它RCDP类型类似，FAR1缺陷患者具有缩醛磷脂缺乏。
我们现在报告了一个由FAR1基因的三种不同杂合新发变异引起的常染色体显性疾病伴痉挛性截瘫和早发性白内障的患者队列。所有变异均位于同一密码子，使得480位置处的精氨酸变为半胱氨酸、组氨酸或亮氨酸。功能分析表明，这些变异不会导致FAR1缺乏，而是导致细胞内缩醛磷脂水平的反馈调节机制丧失，从而导致缩醛磷脂水平增加，FAR1蛋白水平增加，以及患者来源的细胞中脂质的变化。
结果
遗传分析
我们鉴定了来自世界各地的12个具有FAR1（NM_032228.6）新发杂合错义变异的个体：其中4例为c.1439G>A（p.Arg480His）变异，7例为c.1438C>T（p.Arg480Cys）变异，1例为c.1439G>T（p.Arg480Leu）变异（如表1所示）。所有三种变异都没有在gnomAD数据库中报道，并且都被各种致病性预测程序预测为有害的。值得注意的是，所有的新发变异都位于同一密码子p.Arg480中，其位于FAR1的预测跨膜区，该跨膜区由氨基酸466-483氨基酸形成。
具有杂合FAR1 p.Arg480Cys/His/Leu变异的患者的临床特征
12名患者的临床情况总结在表1中，详细情况在补充信息1中。这些患者在收集数据时年龄在2至19岁之间，但都在生命的头几年表现出神经症状。他们表现为锥体束功能障碍，如痉挛性双或下肢截瘫（12/12）、下肢张力过高、躯干张力过低（6/12）和（踝）阵挛。此外，所有患者均有双侧白内障（12/12），先天性白内障5/12，后天性白内障7/12。癫痫发作发生在8/12的患者中，主要发生在出生后的头几个月，似乎适合用巴比妥酸盐、左乙拉西坦和/或奥卡西平治疗。4/8的患者可停止抗癫痫治疗而不再发作。认知延迟和智力障碍在队列中较少见（3/12）。10/12例患者有言语发育延迟，3例患者接受性言语优于表达性言语。仅有一例患者出现生长延迟。所有患者均没有畸形特征；2例患者表现为大头畸形。10/12例患者脑显像在正常范围内；1例患者颞叶形态异常，脑室突出，但白质正常。1例患者蛛网膜下腔良性扩大。
FAR1变异在生化、蛋白质和酶水平上的功能结果
我们研究了鉴定的FAR1变异在患者1-3（携带p.Arg480His变异[n=2]和携带p.Arg480Cys变异[n=1]）的成纤维细胞中的作用。由于报道了FAR1在缩醛磷脂生物合成调节中的作用，我们首先测量了缩醛磷脂水平。与先前报道的FAR1缺乏患者相反，患者的成纤维细胞中的缩醛磷脂水平没有降低，而是升高（见图2a）。此外，与对照受试者的成纤维细胞中的FAR1活性（74、90、101pmol/[h.mg蛋白]）相比，患者1-3的成纤维细胞中的FAR1酶活性显著增加（分别为379、323和310pmol/[h.mg蛋白]）（图2b）。此外，免疫印迹分析显示患者成纤维细胞中FAR1蛋白水平明显增加（图2c）。免疫荧光显微镜分析显示FAR1正常定位于患者成纤维细胞中的过氧化物酶体（见图2d为代表性图像），提示p.Arg480His/Cys变异不干扰FAR1的过氧化物酶体靶向定位。此外，过氧化物酶体的大小和形状正常，过氧化物酶体的功能（非常长链脂肪酸的β-氧化和DHAPAT的活性）正常（未示出）。我们不能研究p.Arg480Leu变异的功能效应，因为没有来自具有该基因型的患者的成纤维细胞。
综上所述，p.Arg480His和p.Arg480Cys突变异均导致FAR1蛋白水平、FAR1酶活性和缩醛磷脂水平升高。
FAR1 p.Arg480His/Cys变异破坏细胞缩醛磷脂水平对FAR1水平的调节
由于已经证明，在正常条件下，FAR1水平和酶活性受到细胞缩醛磷脂水平的负反馈调节，我们假设p.Arg480变异损害了患者中的这种负反馈机制。为了研究缩醛磷脂对FAR1水平的调节，我们将患者和对照者的成纤维细胞在含10 μM 1-O-十六烷基-sn-甘油（HDG）的培养基中培养24和48小时，并研究其对FAR1蛋白水平的影响。HDG可以磷酸化为1-O-十六烷基-sn-甘油磷酸酯，其是一种醚脂合成中间体，在FAR1下游（图1b）。因此，HDG绕过了过氧化物酶体步骤，导致缩醛磷脂水平升高，通过反馈调节，应导致FAR1.水平降低。在对照者的成纤维细胞中，HDG治疗使C16:0-缩醛磷脂水平升高199–291%（mean ±SD: 249 ± 31%）（图3c），并导致FAR1蛋白水平下降31–47%（mean ± SD: 40 ± 7%）（图3a，b）。在患者的细胞中，HDG治疗也使C16:0-缩醛磷脂水平增加了130-224%（mean ± SD: 160 ± 35%）（图3c），但这并没有导致FAR1蛋白水平的持续下降（mean ±SD: 101 ± 17%）（图3a，b）。
应当注意，在未治疗的患者细胞中，平均C16：0缩醛磷脂水平已经比六个对照系中的平均水平高两倍，并且几乎与HDG处理的对照的C16：0-缩醛磷脂水平一样高（图3c）。尽管高缩醛磷脂水平高，但患者细胞中的FAR1蛋白水平比HDG处理的对照仍要高三倍（补充信息2）。
FAR1 p.Arg480His/Cys变异患者的醚脂合成增加
为了研究醚脂合成是否增加，我们用C17：0脂肪酸（C17：0-酸）培养成纤维细胞。这种脂肪酸通常以低水平存在，因此当掺入到复合脂质中时，通过分析由其合成的奇数脂质种类可以较容易地跟踪。除了在非醚脂质中掺入C17：0-酸，允许监测非醚脂质合成之外，FAR1还可以将C17：0-酸转化为C17：0醇，其用于合成醚脂质，提供了跟踪醚脂质合成的方法（图4f）。LPC（17:0）和LPC（O-17：0）的脂质组学分析分别用于比较对照和患者的成纤维细胞中的非醚和醚脂质合成。C17：0-酸在LPC（17:0）中的掺入在对照和患者中相似，而C17-醇在LPC（O-17：0）中的FAR1依赖性掺入在患者中几乎是对照者的四倍（图4g）证实醚脂质合成确实在具有p.Arg480His/Cys变异的患者中升高。
FAR1 p.Arg480His/Cys变异患者成纤维细胞脂质体的显著变化
为了研究FAR1水平调节受损对脂质体的影响，我们在1-3号患者的成纤维细胞中进行了脂质组学实验，并将其与三种对照细胞系进行了比较。我们检测到不同醚脂质种类的显著积累，特别是血浆（a/e）nylcholine醚磷脂种类（PC[O]）和中性醚脂质种类，包括1-烷基-2,3-二酰基甘油（TG[O]，三酰基甘油的醚脂质当量[TG]和1-烷基-2-酰基甘油DG[O]，二酰基甘油的醚脂质当量[DG]）（图4a-c）。虽然血浆（a/e）nylethanolamine醚磷脂种类（PE[O]和LPE[O]）水平有增加的趋势，但由于不同患者细胞的差异，没有达到统计学意义（图4a,b）。对于非醚脂质，患者的DG水平似乎较低，总TG水平显示出较高的趋势（两者均不显著）。主要磷脂磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的总水平都显著降低，PE水平降低尤为显著（图4a,b）。尽管有这些大的差异，含胆碱和乙醇胺的脂质（PE + PE[O] 和 PC + PC[O]）的总量，无论是相对还是绝对，都保持相当恒定（补充图S1）。对仅在sn-1位置上含有脂肪醇的LPC[O]物种的进一步检查表明，具有C16:0-, C17:0-或C18:0-醇的物种是最高的物种（图4d），而具有较长脂肪醇取代基的其它LPC[O]种类较少升高，或不受影响（补充图S2a）。这些LPC[O]种类因此反映了FAR1的底物特异性，其优先使用C16-C18脂肪醇。尽管患者细胞中几乎所有LPC[O]物种都升高，但那些在脂肪酸侧链中具有40-44个碳原子（两个侧链中碳原子的总和）且具有更高数量的双键（因此含有多不饱和脂肪酸PUFAs）的物种显示出最高的倍数变化。相反，相应的含PUFA的PC种类的水平在患者细胞中降低（图4e）。在心磷脂、磷脂酰丝氨酸（缺乏）和TG（积累）中也观察到类似的含PUFA物质的重新分布（补充图S2b d）。总之，升高的FAR1活性导致醚（磷酸）脂质的合成显著增加，同时相应的非醚物质减少，并影响PUFAs在不同主要脂质类别中的分布。
结论
我们描述了一种已知的过氧化物酶疾病基因FAR1的常染色体显性疾病，具有重叠表型，但与隐性FAR1缺陷有不同的潜在疾病机制。我们的发现为FAR1蛋白水平调节醚脂合成提供了基本线索，并表明对于痉挛性截瘫和白内障患者，FAR1应被视为候选基因，并添加到遗传性痉挛性截瘫、脑瘫和青少年白内障的基因组中。最后，红细胞中缩醛磷脂的测量应被认为是醚脂合成的功能读数，因为异常高或低水平都可能提示FAR1相关的病理。