非天然氨基酸的抗体偶联技术，与其他定点偶联技术一样，本质上也是在解决随机偶联技术所造成的产品批间不均一、稳定性差、潜在毒性等各种问题。非天然氨基酸的抗体偶联技术最复杂、最主要的工作是在抗体的制备阶段，即如何在抗体中插入非天然的氨基酸。非天然，顾名思义，便是在动植物体内不存在的氨基酸；因此，如何编码、转运、插入携带各种官能团（偶联位点）的非天然氨基酸就成了首要解决的问题。
tRNA组合物：nnAA偶联技术基石
在蛋白质合成过程中，DNA、mRNA、tRNA、氨基酸和氨酰tRNA 合成酶等功能体及相应的监视系统共同参与。在氨酰 tRNA 合成酶的作用下，每一个 tRNA 与对应的氨基酸结合形成氨酰 tRNA，再通过其反密码子与 mRNA 上的密码子互补，将相应的氨基酸连接到正在合成的多肽链上。
Schultz实验室最早开发出非天然氨基酸蛋白质定点修饰技术，通过在细胞或细菌内引入能够特异性识别非天然氨基酸的外源tRNA以及相对应的氨酰tRNA合成酶，催化特定氨基酸与tRNA结合，在进入核糖体后，识别mRNA上的琥珀终止密码子（UAG），实现定点插入[1]。
在插入非天然氨基酸的过程中，tRNA、氨基酸和氨酰 tRNA 合成酶是相互对应、正交组合的，即一种 tRNA 只能与一种氨基酸结合，氨酰 tRNA 合成酶只能结合一种氨酰 tRNA，否则就无法实现从 DNA 到mRNA 再到蛋白质的严密的信息传递，也就无法合成所需的蛋白质。这种非天然氨基酸正交翻译技术也称之为遗传密码子扩展技术，利用终止密码子在蛋白翻译过程中将非天然氨基酸插入到蛋白质的氨基酸序列中[2]。
参考文献2：非天然氨基酸（Pyl）定点插入机制图示
终止密码子之外，四联（五联）密码子和再分配的有义密码子以及引入非天然碱基的特殊密码子等技术也在积极探索。根据文献报道，迄今已实现200多种非天然氨基酸的插入，包括60余种是采用改造的古细菌詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschi；M. jannaschii）的tRNA/酪氨酰tRNA合成酶正交对插入[3]，这也就形成了最初的tRNA组合物。
Ambrx: nnAA偶联技术实践者
作为较早运用非天然氨基酸定点偶联技术的公司，Ambrx在2005年就有相关专利申请（CN101273140），涉及正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和正交tRNA/合成酶对的组合物，专利要求中声明的tRNA同样来自詹式甲烷球菌。2008年，Ambrx将该技术拓展至脊椎动物细胞(CN101528914)。
Ambrx网站信息显示，基于tRNA/tRNA 细胞株对（正交组），利用专有的细菌平台 (ReCODE 平台™) 或酵母和哺乳动物细胞平台 (EuCODE 平台™) ，Ambrx可以在任何治疗性蛋白质或抗体上进行抗体偶联药物的开发。
来源：Ambrx网站
当然，对于引入非天然氨基酸的位点，也不能影响抗体功能，比如疗效、结合力等。ARX788中，毒性载荷的Linker（AS269）结合在HER2单抗重链丙氨酸121和对应的丙氨酸114两个位置，形成DAR值为2（约1.9）的抗体偶联药物。
来源：adc.bocsci.com和文献4
（左：ARX788偶联图示；右：ARX788）
文献[1,4]和专利披露的信息中，Ambrx更多的是探讨引入乙酰基氨基酸，如ARX788，对应的形成类似羟肟的结合形式。Linker与抗体通过肟、腙等形式组成的ADC药物，被质疑在循环中存在不稳定性，Linker容易从抗体脱落导致脱靶毒性。然而，数据显示[4]，ARX788具有良好的稳定性。
但是，无论采用原核生物（大肠杆菌）还是真核细胞（酵母）系统，与天然氨基酸存在相应的转运系统不同，非天然氨基酸均涉及如何转运至表达系统中的问题；同时，也存在定点引入和释放因子（RF1/RF2）之间的竞争。而且，对于需要引入不同官能团的非天然氨基酸作为偶联位点时，不可避免需要增加筛选工作。因此，Sutro公司开发了一种体外无细胞蛋白质合成体系，用于开发非天然氨基酸定点插入抗体。
Sutro：nnAA偶联技术持续突破
2010年， Sutro公司申请了一项利用体外蛋白合成系统将非天然氨基酸引入蛋白的专利（CN102348807）。具体来说，涉及使用非正交天然同功有义tRNA，该技术允许通过有义密码子将多个非天然氨基酸并入，而不必依赖正交tRNA-合成酶对。该专利中也披露了Sutro基于细胞（大肠杆菌）来源提取物的体外蛋白合成系统，不需要完整的功能细胞，有望摆脱固定的生化和生物物理参数限制。
来源：WO2010081111/Sutro网站
来源：Sutro网站
但是，对于Sutro而言，或许M1231更具代表性。M1231是Sutro和默克（EMD Serono）合作开发的一款MUC1/EGFR特异性双抗ADC，已经在2021年1月开始实体瘤适应症的临床研究（NCT04695847）。M1231同样采用非天然氨基酸定点偶联技术，基于Sutro不对称重链专有SEED结构（链交换工程域）和无细胞生产技术平台（XpressCF）开发的一款双靶点的特异性双抗偶联药物，通过可裂解（Val-Cit）接头将潜在基于微管蛋白作用机制的hemiasterlin相关毒性载荷与双特异性抗体偶联，实现结构同质性和稳定DAR。
来源：www.merckgroup.com
结语
ADC药物和相关赛道的持续火热，吸引了国内外企业的共同关注。ADC技术也在不断突破和进步，在日新月异的技术变革之下，企业采用哪种ADC技术是影响后续产品开发非常关键的因素之一。而在选定和拥有相应的ADC技术之后，创新性治疗靶标的发现将是企业面临的下一个挑战。
参考文献：
1.梁学军等，非天然氨基酸定点偶联抗人类表皮生长因子受体2-抗体偶联药物的药理学活性. 北京大学学报（医学版）：vol5, 797
2. 李瑞洋等，非天然氨基酸正交翻译技术：一种新型基因工程活病毒疫苗研发技术. 生物工程学报：vol36, 891
3. 黄焕邦等，基于古菌酪氨酰 tRNA 合成酶非天然氨基酸插入的研究进展. 中国生物工程杂志：2021-05-20：https://doi.org/10.13523/j.cb.2104047
4. Prathap Nagaraja Shastri，et al. Nonclinical Development of Next-generation Site-specific HER2-targeting Antibody–drug Conjugate (ARX788) for Breast Cancer Treatment. Mol Cancer Ther; 19(9):1822-1832
5. Lillian Skidmore, et al. ARX788,a Site-specific Anti-HER2 Antibody–Drug Conjugate, Demonstrates Potent and Selective Activity in HER2-low and T-DM1–resistant Breast and Gastric Cancers. MolCancer Ther; 19(9):1833-1842
6. Erik S. Zimmerman，et al. Production of Site-Specific Antibody−Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural AminoAcids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 351−361