2021年6月23日，美国北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）由Greg Wang（王刚）和Douglas H. Phanstiel领导的两个研究团队在Nature杂志在线发表论文，题为 “Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development（相分离促进三维染色质环的形成以及癌症的发生）”[1]，揭示了内部无序序列（IDR）在癌变过程中的重要作用。
在多种急性白血病亚型中，染色体易位 (chromosomal translocation) “错误”地将一部分源自于Nucleoporin 98 蛋白 (NUP98) 的片段连接到一个转录因子(Transcription factor)或染色质结合因子(Chromatin-binding factor)上，从而形成一个嵌合癌变蛋白 (chimeric onco-protein) [2,3]。转录因子和染色质结合因子直接参与基因表达和染色质调控。在人类白血病中，现已知有三十多个不同的转录因子或染色质结合因子参与和NUP98的染色体易位以及嵌合癌变蛋白的形成。Nucleoporin 214 蛋白 (NUP214)也发现参与白血病中的染色体易位以及嵌合癌变蛋白的形成。
北卡罗来纳大学的团队研究了这一系列癌变蛋白中最为经典的一个：NUP98-HOXA9 (图1)。NUP98-HOXA9嵌合癌变蛋白包含了源自于HOXA9的 DNA结合结构域 (homeodomain)以及源自于NUP98的“内部无序序列 (IDR)”片段。NUP98的IDR为一段富含芳香族氨基酸的序列，共有38个由“苯丙氨酸+甘氨酸”组成的简单重复 (38个 Phenylalanine-Glycine repeats 或 FG-repeats), 这是一个似乎缺乏驱动高阶折叠结构的蛋白序列。
图1。NUP98-HOXA9是一个经典的和白血病相关的染色体易位(chromosomal translocation)。
近来的研究发现富含芳香族氨基酸的序列或简单重复与细胞中的相分离 (Phase separation) 现象有关[4-6]。相 (Phase) 是一种常见的物理现象，细胞中相分离无处不在。生物大分子的“相变” (Phase transition) 可以在异常复杂的细胞内部形成一个个可以区分开的区室或隔间(compartment), 区室化 (compartmentalization) 就像往水里点油一样，让不同的细胞结构和元件互不干扰地工作。
北卡罗来纳大学的团队研究发现NUP98的IDR能够单独发生液-液分离相变 (liquid-liquid phase separation)，液-液分离相变的发生与IDR的蛋白浓度以及IDR 中FG-repeats的价(valency)呈正相关。在细胞中，NUP98-HOXA9蛋白则形成液滴状聚集体（droplet-like condensate）并可以聚结（coalescence）形成更大的液滴聚集体(图2)。
该团队把NUP98 IDR中所富含的芳香族氨基酸 (Phenylalanine苯丙氨酸) 突变为非芳香族氨基酸 (Serine丝氨酸)，那么NUP98-HOXA9的液-液分离相变就不会发生。可以发生液-液分离相变的嵌合蛋白（含FG repeats的NUP98-HOXA9）会造成癌变，而不可液-液分离相变的嵌合蛋白突变体（含Phenylalanine-to-Serine [FS] 突变的NUP98-HOXA9）不会造成癌变。
该团队进一步把NUP98的IDR置换为源自于FUS的IDR（这个FUS IDR可发生液-液分离相变[6]），那么形成的嵌合蛋白FUS-HOXA9同样会造成癌变。因此这一类液滴聚集体与癌变相关，可被称为“癌变液滴聚集体”（onco-condensate）.
图2。NUP98-HOXA9形成液滴状聚集体（droplet-like condensate；见上左）并可以聚结（coalescence）形成更大的液滴聚集体（见下）。注意这里用的NUP98-HOXA9是一个DNA结合结构域的突变体（N51S）[7,8]，这个突变体不受DNA结合的限制从而更自由地聚结。图上右是含Phenylalanine-to-Serine [FS] 的突变体。
该团队用ChIP-seq和RNA-seq对 (a) 可以液-液分离相变的嵌合蛋白（含FG repeats的NUP98-HOXA9）和 (b) 不可液-液分离相变的嵌合蛋白突变体（含Phenylalanine-to-Serine [FS] 突变的NUP98-HOXA9）进行了比较。研究结果发现前者和 DNA结合的能力非常强，而后者和 DNA的结合则变得弱很多。同时前者可以在一系列的致癌原基因(proto-oncogene)上形成“超级增强子”(super-enhancer)的成簇分布 （图3）。
该团队还采用了single-molecular imaging 技术，发现那些可以液-液分离相变的嵌合蛋白则和染色质结合更为强，这些蛋白的总体移动也较小。更强力的DNA结合以及 “超级增强子” 的形成可以导致致癌原基因在细胞中更强得表达。
图3。和不可发生液-液分离相变的嵌合蛋白突变体（含IDR Phenylalanine-to-Serine [FS] 的突变）相比较， 可以发生液-液分离相变的嵌合蛋白（含野生型 [IDR WT] FG repeats的NUP98-HOXA9）与DNA结合的能力非常强，同时含野生型 IDR的NUP98-HOXA9可以在致癌原基因(proto-oncogene)上形成超级增强子的成簇分布 (super-enhancer clusters)。EV为empty vector control; +D为 1,6-己二醇（1,6-hexanediol）的药物处理（1,6-己二醇可以通过破坏疏水相互作用从而破坏液滴状聚集体）; +V为对照药物(+vehicle)处理。
该团队进一步用Hi-C比较了 (a) 可以液-液分离相变的嵌合蛋白（含野生型 IDR的NUP98-HOXA9）和 (b) 不可液-液分离相变的嵌合蛋白突变体（含FS 突变的NUP98-HOXA9）。结果发现前者在致癌原基因上形成染色质环结构(chromatin loops)。 染色质环结构可以将多个增强子同时招募到致癌原基因(proto-oncogene) 上，从而导致癌基因更强的激活 （图4）。
需要注意的是，这一类型的染色质环结构与另一类型由CTCF形成的经典染色质环结构并无直接关系，所以这是一种新型的由液-液分离相变的转录因子蛋白所形成的染色质环结构。
图4。见上图: 在PBX3致癌原基因(proto-oncogene)上由液-液分离相变的转录因子蛋白所形成的染色质环结构。见下图: 相变的嵌合转录因子蛋白通过同时结合癌基因(proto-oncogene)和许多个远端的增强子（distal enhancers），从而形成染色质环结构 (chromatin looping)。Illustration credit to Erika Deoides.
因此这一研究工作将液-液分离相变和一系列的现象直接联系到了一起，这其中包括了(a)癌基因的激活和癌症的发生，(2)“超级增强子” 的形成以及 (3)染色质环结构 (chromatin looping) 的形成。理解相分离的形成和调节机制以及其物理化学本质是继续吸引许多研究者的一个问题，同时生物大分子的"液-液"相分离在许多其他的生理疾病(比如老年痴呆)中也可能起同样重要的作用，这都有待后续的研究。
北卡罗来纳大学教堂山分校Greg Wang(王刚)和 Douglas H. Phanstiel博士为本文的共同通讯作者。北卡罗来纳大学教堂山分校Jeong Hyun Ahn博士为第一作者。Wang和Phanstiel团队参与共同研究。合作实验室包括北卡罗来纳大学的Wesley R. Legant和Ling Cai课题组、爱因斯坦医学院的Deyou Zheng 课题组和阿肯色大学的Alan J. Tackett课题组。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03662-5
参考文献
1,Ahn, J. H. e. a. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-021-03662-5 (2021).
2,Michmerhuizen, N. L., Klco, J. M. & Mullighan, C. G. Mechanistic insights and potential therapeutic approaches for NUP98-rearranged hematologic malignancies. Blood 136, 2275-2289, doi:10.1182/blood.2020007093 (2020).
3,Gough, S. M., Slape, C. I. & Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood 118, 6247-6257, doi:10.1182/blood-2011-07-328880 (2011).
4,Schmidt, H. B. & Gorlich, D. Nup98 FG domains from diverse species spontaneously phase-separate into particles with nuclear pore-like permselectivity. Elife 4, doi:10.7554/eLife.04251 (2015).
5,Alberti, S. & Hyman, A. A. Biomolecular condensates at the nexus of cellular stress, protein aggregation disease and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol 22, 196-213, doi:10.1038/s41580-020-00326-6 (2021).
6,Wang, J. et al. A Molecular Grammar Governing the Driving Forces for Phase Separation of Prion-like RNA Binding Proteins. Cell 174, 688-699 e616, doi:10.1016/j.cell.2018.06.006 (2018).
7,LaRonde-LeBlanc, N. A. & Wolberger, C. Structure of HoxA9 and Pbx1 bound to DNA: Hox hexapeptide and DNA recognition anterior to posterior. Genes & development 17, 2060-2072, doi:10.1101/gad.1103303 (2003).
8,Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. & Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Molecular and cellular biology 20, 3274-3285 (2000).