2021年7月23日,华中科技大学罗迪贤及南华大学胡政共同通讯在Molecular Biotechnology 在线发表题为“Identification of a Novel Cleavage Site and Confirmation of the Effectiveness of NgAgo Gene Editing on RNA Targets”的研究论文,该研究证实NgAgo在体外和体内可以进行RNA编辑。
然后,该研究设计了体外RNA切割系统,并通过测序验证了切割位点。此外,将 NgAgo 和 gDNA 转染到细胞中以切割细胞内靶序列。该研究在体外和体内证明了 NgAgo 以 gDNA 依赖性方式靶向降解 GFP、HCV 和 AKR1B10 RNA,但未观察到对 DNA 的影响。测序表明切割位点位于目标 RNA 的 3',被 gDNA 的 5' 序列识别。这些结果证实 NgAgo-gDNA 切割的是 RNA 而不是 DNA。该研究观察到切割位点位于靶标 RNA 的 3'端,这是过去未报道的新发现。
基因编辑是一种通过靶向修饰改造基因组的新技术。自发现以来,CRISPR/Cas9系统已成为基因组编辑库中最强大的工具之一。尽管 CRISPR/Cas9 系统受到研究人员的欢迎,但它也有其不完善之处。CRISPR/Cas9 系统对靶标识别的几种脱靶活性和 PAM 要求限制了其在某些基因组序列中的应用。因此,寻找新的基因编辑方法仍然是一个好的选择。除了 Cas9 蛋白家族外,有研究报道 Argonaute (Ago) 蛋白家族,包括 TtAgo和 PfAgo,也具有一定的基因编辑能力。
在原核生物和真核生物中都发现了 Argonautes。在真核生物中,Argonaute 蛋白是 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC)的重要组成部分。真核生物 Ago 蛋白在 RNA 干扰 (RNAi)、microRNA 和 piwi 相互作用 RNA (piRNA) 介导的转录后沉默中起着至关重要的作用。一些原核 Ago 蛋白,如 TtAgo 和 PfAgo,可以诱导外源基因在小干扰核酸或引导 DNA (gDNA) 的指导下降解 。然而,TtAgo 和 PfAgo 通常在 65 °C 左右起作用,限制了它们在哺乳动物细胞中的应用。
2016年5月3日,韩春雨团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的研究论文,该研究发现Natronobacterium gregoryi Argonaute(NgAgo)是一种DNA引导的核酸内切酶,适用于人类细胞的基因组编辑,这一下子使NgAgo火遍全球,广大研究人员去验证其效果,很不幸,没有相关的团队能确定NgAgo有基因编辑的功能。随后引发广泛质疑,2017年8月3日,韩春雨撤回该论文。
不过,其他团队有另外的发现,南通大学刘东团队在Cell Research 发表题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的研究论文,该研究发现gDNA / NgAgo可以与靶基因结合以阻断其转录,同时该研究也没有发现NgAgo具有基因编辑的能力。
多项研究表明,NgAgo 可以作为 DNA 引导的内切核糖核酸酶发挥作用,以靶向方式切割 RNA。NgAgo-gODN 系统可以切割编码人类 DYRK1A 基因外显子 11 的 RNA 转录本(注:该研究发表在预印版平台bioRxiv上,未经过同行评审)。另一项研究表明 NgAgo-gDNA 系统通过加速前基因组 RNA 的衰变有效抑制乙型肝炎病毒的复制。尽管如此,在他们的研究中没有确定切割位点。
在本研究中,该研究也未能检测到 NgAgo-gDNA 系统的任何 DNA 编辑效应。该研究结果证实了 NgAgo-gDNA 在体外和体内对 RNA 的编辑作用,并进一步验证了新的切割位点。
该研究设计了体外RNA切割系统,并通过测序验证了切割位点。此外,将 NgAgo 和 gDNA 转染到细胞中以切割细胞内靶序列。该研究在体外和体内证明了 NgAgo 以 gDNA 依赖性方式靶向降解 GFP、HCV 和 AKR1B10 RNA,但未观察到对 DNA 的影响。测序表明切割位点位于目标 RNA 的 3',被 gDNA 的 5' 序列识别。这些结果证实 NgAgo-gDNA 切割的是 RNA 而不是 DNA。该研究观察到切割位点位于靶标 RNA 的 3'端,这是过去未报道的新发现。
不过,由于该研究结果比较初步,仍需进一步实验证实NgAgo在体内对于RNA的编辑能力。另外,对于该研究你怎么看?
参考消息:
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12033-021-00372
DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute. BioRxiv. https://doi.org/10.1101/101923