尽管性发育障碍（DSD）是全世界最常见的先天性发育疾病之一，但由于缺乏认识和研究资金的支持，因此，对其最佳管理模式仍然不确定。在DSD表型的掩护下，由于分子遗传学诊断常常无法得出可靠结果，因此确定个体状况是一项挑战。这对患者及其家属产生了心理社会和健康相关的影响。新的基因组学方法有可能通过更好地检测蛋白质编码变体和确定未被充分认识的病因（如嵌合体、结构的、非编码或表观遗传的变体）来解决这一僵局。最终，希望得到更好的结果数据、对分子机制的更好理解以及更高的公众认知，进而结束与DSD患者相关的耻辱感。
基因检测在临床的应用
DSD诊断的传统方法是逐步分层，从临床表型和核型分析开始，以确定随后的内分泌分析，然后进行基因测试（通常仅限于单个候选基因）以解决疑难病例。多年来，人们提出了许多算法，试图简化诊断过程，但在遗传诊断方面还需要取得进展。除了CAH和染色体DSD（如45、X和47、XXY和变异）之外，临床上可用的基因检测技术无法对超过一半的病例进行分子诊断。其中，46，XY核型的 DSD诊断率特别低。
新生儿的先天性肾上腺皮质增生（CAH）筛查
由于CYP21A2缺乏（~1:15000），46，XX核型的生殖器异型性个体中绝大多数（90–95%）DSD与CAH相关。由于与这种疾病相关的危及生命的盐代谢异常可以治疗，因此，CYP21A2缺乏症现在是世界许多地区新生儿筛查的一部分。然而，最近对美国各州使用的方案进行的一项调查表明，标准和技术没有标准化，导致测试阳性预测值（PPV）很低，从0.7%到50%不等。该检测是生化测试，但因为该致病基因的检测很复杂，不适合筛查。大多数CAH病例仅通过内分泌测试进行诊断，因此，我们对基因型和预后之间的相关性的理解仍然不足以使治疗适应特定的基因型。
性染色体核型鉴定
对于不典型生殖器的新生儿的评估，核型分析仍然是参考的测试（表2）。然而，建议对X和Y染色体和SRY进行间期荧光原位杂交，因为该检测速度更快（24小时比1-2周）。约15%的DSD被认为是染色体DSD，包括Klinefelter综合征、具有Y染色体参与的Turner综合征变异体（通常为嵌合体45，X/46，XY，带或不带等双着丝粒Y），X染色体片段缺失或含有SRY的Y片段易位到X染色体.无创产前筛查（NIPS）通过游离细胞DNA检测非整倍体，许多父母现在可能在怀孕10周左右就知道了他们孩子的性染色体，因此DSD也越来越多地通过这种方式确定。这种筛查对性染色体的准确性低于唐氏综合征的染色体核型分析（唐氏综合征的敏感性和特异性接近100%）。据报道，性染色体非整倍体NIPS的PPV为32–57.6%，45，X（特纳综合征）的PPV为18–21%，Klinefelter综合征（47，XXY）的PPV为39%–90%。
如果NIPS表明性染色体的完整性正常，随后的超声显示其他性别的典型生殖器（在报道的妊娠女性中1/14300）可能提示DSD。在一系列研究中，约1/3的病例（试管贴错标签或超声波性别识别错误）诊断有误，DSD在出生时实际诊断率为36%。因为NIPS只是一个筛查，需要进行后续的确认性基因检测（核型或微阵列），并为此制定了处理方案。
染色体芯片
染色体微阵列的出现揭示了小而隐蔽的拷贝数变异（CNVs）是一种被忽视但罕见的DSD病因。性染色体非倍体，以及SOX9、WNT4或NR0B1的编码区和调控区的缺失或重复，已被证明可导致DSD（对基因，检测条件和基于研究的方法进行了综述）。基因表达剂量阈值效应也可以解释在几种情况和谱系中观察到的不完全外显率，这给诊断带来了极其复杂的因素。CNVs也可能是DSD发展过程中复发发病机制的病因基础，如泄殖腔畸形或Mayer–Rokitansky–Küster–Heuser综合征。
染色体微阵列是检测CNV的参考方法，即使在临床上嵌合体形式也可以识别CNV（如果CNV存在于超过20–30%的细胞中）。它们通常在DSD综合征病例中提供答案，偶尔也在孤立病例中提供答案（例如，DSD-TRN登记册中14%的病例通过染色体微阵列诊断）。尽管目前阵列上探针的高密度可能允许检测更小的CNV，但是临床实验室通常报告CNV大于25–50 kb，这比一些DSD基因还大。在SDS研究中，一个研究生物信息学工具专门用于DSD中较小（大于1kb）CNV的检测和功能注释。在52个病例中，上述工具鉴定出超过300个CNV重叠的68个DSD基因。这些变体的致病性验证有待在其他队列中进行复制，并在临床部署该工具之前进行体外验证实验。
单基因检测
当临床上发现CAH时，建议进行单基因检测，因为可能存在一定程度的表型-基因型相关性，以区分盐代谢紊乱、简单男性化和非经典型。对于这种情况和其他情况，一旦先证者中确定了一种变体，有针对性的Sanger测序就很有用，以确定复合杂合子变体的阶段和遗传或从头状态。由于条件和大量候选基因之间的表型重叠，单一候选基因测试（无论是通过NGS还是Sanger测序）在其他情况下通常是无效的。事实上，对两种最常见的46，XY DSD（雄激素受体（AR）基因和SRD5A2）单基因测试的分析DSD-TRN登记显示约40%的AR和约55%的SRD5A2试验返回阴性结果。
外显子测序
为了在几十个已知的DSD基因中识别SNV或小indels，目前选择的方法是使用覆盖基因蛋白质编码区的短读长（~150 bp）进行大规模平行测序（最近对临床外显子组测序方法和最佳实践进行了回顾）.可通过富集（靶向捕获一组已知致病基因）或不富集（“整”外显子捕获，报告仅限于选定基因）来执行.经过专业设计的检测板（30-180个DSD基因）在研究环境中显示了很高的诊断率，以及时间和成本效益，但这些通常不是商业上可获得的。由专家委员会解释的临床全外显子组测序（WES）在46，XY 的DSD中有35%得到确诊。
用于DSD检测的WES和panel具有各自的优势。当一个新的致病基因被发现，病人被重新测试时，panel需要被重新设计，WES允许简单的再分析和基因发现。然而，捕获试剂盒已经发生了巨大的变化，一些DSD基因在较旧的外显子组测试中捕获效果很差，即使重新分析，未捕获区域的变体也会丢失。对于WES，无论是针对（已知的临床基因，覆盖约30 Mb的基因组）、全外显子组（45 Mb）还是扩展（到相邻的非编码区，60 Mb）捕获，都会极大地影响可发现变异的数量。测序平台和分析途径也在迅速发展，患者和提供者都越来越难以理解测试的结果说明了什么，因为几年后的“相同”测试可能会导致不同的结果。
全基因组测序
全基因组测序（WGS）虽然基于相同的短读测序（SRS）原理，但避免了外显子组测序或panel的捕获限制。WGS已被证明可扩大罕见儿科疾病的诊断利用率并改善临床管理。WES遗漏了每个个体约650个真实的变异（编码变异的3%），但是WGS能够检测到，这要归功于更均匀地覆盖富含GC且难以捕获的外显子。此外，WES的假阳性SNV比例远高于WGS（78%对17%）。因此，单独使用WGS可以提高已知DSD基因蛋白质编码区的诊断率。早期迹象表明情况可能如此，但支持证据尚未公布。
此外，WGS允许检测外显子以外的变体，例如在已知DSD变体来源的基因启动子、内含子或增强子中发现的调控元件中。目前，ClinVar数据库中报告的89%的致病性变体是编码序列（如果包括相邻区域，则为99%）。然而，外显子组仅占基因组的1–2%，单用外显子组测序预计会遗漏许多因果变异。在美国，儿童国立医院和Rady研究所最近率先将其经认可的流程到WGS，作为临床基因检测的主要技术，但DSD panel尚未提供。由于成本仍远高于WES，且非编码区变异的可解释性有限，因此WGS尽管有明显的技术优势，但对供应商来说临床试验的当前吸引力有限。
提高SDS变异体的检测
目前的临床技术主要检测编码SNV和杂合或纯合状态的大CNV。当检测其他类型的变异和病因学的方法在临床上可用时，检测率应该会提高，例如嵌合体状态的变异、寡基因病因学、复杂基因组变异和表观遗传变异——所有这些都是已知但尚未确定的DSD病因。下文讨论了用于改进这类变异检测的新兴临床前方法
嵌合体
嵌合现象和嵌合体被报道为DSD病因，可能是漏诊、表型变异和外显率降低的原因。Turner综合征的嵌合体45，X/46，XY变异通常表现为混合性性腺发育不全，两个性腺的组织解剖结构不同。嵌合体X染色体失活，解释了XX个体通过Y-X易位机制的表型变异。由于缺乏合适的临床可用技术，其他DSD基因变异的嵌合体可能被低估。特别是，更好地检测嵌合体有望提高卵黄性DSD和其他导致不对称生殖器表型的疾病的诊断率，这些疾病的表型在已知疾病谱中属于轻度；或在已知的综合征DSD基因中，当DSD条件以分离形式出现时。
在Turner综合征变异体中，NGS比核型或微阵列检测Y物质更敏感，但标准变异体检测流程不足以检测低水平嵌合体。他们假设一个二倍体基因组，覆盖深度（WES约100✖，WGS约30✖）对于的嵌合体变异来说太低。应用于高读取深度（1000×）的有针对性的SRS应允许对这些隐藏的DSD病因进行可靠检测。
寡基因病因学
多基因变异的参与已被假设为解释遗传病因学个体的表型变异。例如，NR5A1/SF1的变异与表型相关，从46，XX个体的孤立性肾上腺功能不全、卵巢早熟功能不全或卵黄性DSD到典型男性的隐睾或不孕症，以及46，XY个体的女性生殖器不明确或性腺发育不全。在这和其他形式的DSD中提出了一种寡基因遗传模式，其他基因中的变异解释了表型的变异。然而，目前的生物信息学流程并不是为有效识别寡基因而设计的。出版物已开始共享即使在已解决的案例中发现的其他变体的列表帮助确定其他基因对DSD表型变异性和致病性的贡献。
结构变异
结构变异中断DSD基因的编码区或改变调控区周围的基因组结构可导致DSD。尽管微阵列能够可靠地识别遗传物质的大量得失，但它们对平衡的重排、反转或易位却视而不见。WES和WGS通用的SRS方法无法准确检测大型或复杂的结构差异。已经开发了几种能够检测复杂结构变体的技术，这些技术具有互补的优势，它们的联合使用将有必要充分认识到目前尚未确定的结构变体在DSD中的作用。下面，我们讨论基因组光学映射（OGM）和长读序列（LRS），以及目前阻碍其临床应用的障碍（有关识别SRS、LRS和OGM中结构变体的技术和算法的详细信息）
OGM可检测大小为500 bp至百万碱基的变异。
OGM（由Bionano基因组学平台支持）可识别具有高度特异性和敏感性的大型和/或复杂结构变异。OGM图像显示了整个基因组中以特定序列基序荧光标记的大碱基大小的DNA分子。长DNA分子内荧光标记的合成模式用于样品基因组的每个等位基因的从头组装。
LRS擅长检测50 bp–5 kbp范围内的结构变体。
LRS有时被称为第三代测序，产生大于10kb的读码，长度可达兆碱基（与临床SRS的典型150bp相比），极大地促进了基因组中由于重复元件或伪基因而难以测序的区域的序列定位。LRS在医学遗传学中的作用正在显现。目前主要有两种技术：基于纳米孔的测序（由牛津纳米孔技术公司开发）和单分子实时（SMRT）测序（由太平洋生物科学公司开发）。
表观遗传变异
生殖器异型性是一些印记疾病的一部分，如Prader-Willi（人类在线孟德尔遗传（OMIM）176270）、Beckwith-Wiedemann（OMIM 130650）和IMAGe93（OMIM 614732）综合征。DSD基因启动子的甲基化变化和组蛋白修饰已被证明会影响哺乳动物的性别决定，并且至少有一例报道了46，XY女性SRY上游甲基化与父亲相比的差异。
全基因组DNA甲基化分析的诊断效用最近得到证实，包括生殖器受累综合征（Cornelia de Lange、歌舞伎化妆综合症、生殖小卫星、ATRX和CHARGE综合征）。对表观突变（单基因座）和外显信号（跨多基因座）的系统分析可能既能识别新的DSD病因，又有助于解决未知意义的变异（VUS）。除了通过SRS或SNP阵列使用亚硫酸氢盐转化的现有技术外，通过基于纳米孔的测序或SMRT技术的LRS和OGM都有望检测同一长DNA分子的表观遗传和遗传变异。改善表观遗传数据的整合（DNA甲基化，如微阵列所示，他对序列和结构变异分析算法的修改、印迹区域）将是提高DSD诊断率的关键。
改进SDS变异的验证
典型地，WES和WGS分别识别每个基因组约21000和约300万个变体，WGS变体主要发现于非编码区，其可解释性甚至低于编码序列。使用预先建立的与表型、群体频率、预测的蛋白质损伤效应和先前报道的在相同条件下发生的相关基因列表进行变异筛选，有助于优先考虑潜在致病性变异。然而，可以自信地称之为致病性变体的可能性很低，因为几十个DSD基因中的许多基因的致病性证据非常低。许多基因已经报道过一次，但在体外或体内对其有害性的证据有限。将验证研究结果纳入变量解释算法的现有指南（例如，参考文献和SVI关于使用ACMG/AMP标准的一般建议）侧重于传统的低通量分析，这与NGS产生的数据量不同步。需要多重、高通量分析，但设计DSD特异性分析是复杂的，因为它们需要与每个基因和受影响的组织类型相关。
改进参考数据库的管理
2015年发布了28项ACMG/AMP变异分类标准（从致病性到良性），随后创建了自动化分类的工具，如VarSome、Franklin和Sherloc。这些和临床平台使用ClinVar和/或UniProt变体库对“信誉良好的来源”标准进行评分（PP5和BP6）。然而，最近的一项详细分析表明，在ClinVar中对DSD基因的注释严重不足。在体外验证的支持下，许多已发表的致病基因变体已被证实,但尚未策划并纳入数据库。因此，致病性的证据可能被高估或低估，即使是众所周知的DSD基因。有关更多基因、变体类型和相关参考文献的数据，例如，ClinVar在AR基因中仅包含109个变异体，而AR突变数据库（截止到2014年）注释了大于550个变异体。对于由抗苗勒管激素（AMH）或其受体（AMHR2）变异引起的持续性苗勒管综合征，ClinVar包含四种AMH和五种AMHR2致病性变异。它们由历史出版物策划并由OMIM保存，但来自最大出版系列的另外20多个变体没有保存。
未知意义变异（VUS）的验证
报告群体频率的数据库的出现极大地帮助了对变异的优先排序，但需要开发新的方法并将其引入临床试验领域，以便对下一代基因组测序和绘图所发现的数千种变异进行分类。
整合转录组分析
RNA-seq图谱可用于评估VUS的功能后果和疾病状态的分子表型。如果一个变异可能导致剪接、等位基因倾斜、RNA不稳定性或表达水平的改变，则可以直接查问RNA-seq数据。或者，来自多个DSD样本的RNA-seq数据集可以根据表达谱和被调查的组进行分组，以搜索常见的致病变异体。为了促进这些分析，整合RNA-seq图谱与WGS和微阵列数据的平台需要变得更加用户友好，并可供更广泛使用。然而，基于转录组的VUS验证的实用性受到相关组织的可用性的限制，在该组织上执行RNA-seq。只有大约一半的已知DSD基因在血细胞中表达，而在皮肤成纤维细胞中表达的比例略高。对于许多起源于发育中胚胎的DSD来说，相关组织是不可用的。即使是接近的替代物，如成人生殖器或性腺组织，也很少可用。
非编码变体的解释
已知DSD基因中的致病性非编码变异体已被报道，致病性结构变异体已在编码区外、启动子和增强子中被鉴定。例如，AR基因上游增强子的复制被证明可增加表达，而运动区的复发性变体导致异常翻译和完整AIS。SRY启动子中3-bp的缺失部分删除了SP1转录因子的结合位点，导致46，XY完全性腺发育不全。其他例子包括SOX3、DMRT1或NR0B1/DAX-1调控区的变体。研究得最好的例子是令人惊讶的复杂SOX9调控区。影响SOX9非编码区的变异导致至少四种不同的情况，包括46，XX睾丸DSD和长骨疾病钟状体发育不良，这与46，XY个体中75%的DSD相关。鼠与鼠之间的非保守性，人类基因组使动物模型中DSD变异的研究复杂化。
DSD特定的细胞模型。
对于许多DSD基因，如SOX9，由于缺乏进化序列保守性，非编码变体无法在动物模型中进行测试。细胞模型可能是评估VUS和影响发育中性腺中存在的分子途径的候选基因的有力工具。多能性人睾丸胚胎癌NT2/D1细胞系表达SRY和SOX9下游的调节途径，并对SOX9扰动作出响应，与早期性别决定期间观察到的类似。SOX9是维持支持细胞完整性的关键，并控制性腺发育中的大量生物过程。SOX9在许多XX和XY DSD中过度表达或表达不足。因此，NT2/D1是检测DSD变异引起的基因网络扰动模式的有力筛查工具。
改进临床实践
国际罕见疾病研究联合会（IRDiRC）设定的理想目标包括呼吁在患者就医后1年内获得准确诊断。然而，许多患有DSD的个体经历了多年的内分泌测试、成像和诊断手术，却没有得到诊断。激素分析可能无法可靠地区分不同条件之间的差异，实践也存在很大差异。欧洲正在努力使DSD中的实验室评估标准化。但除了内分泌测试外，2006年和2016年的共识声明强调了跨学科关怀的必要性，其中需要包括订购适当基因测试和解释结果。DSD-TRN登记数据显示，在网络中心未确诊的患者中，97%的患者没有完成临床可用的基因测试。原因可能包括保险公司或卫生当局不愿意授权检测、检测机会有限以及对基因检测的不适，但也可能反映出临床医生的习惯或团队中缺乏遗传学保障。
优先基因检测
建议将基因检测作为综合方法的一部分，并在跨学科决策之前进行平行解剖和生化评估，并应视为护理标准。据报道，DSD和其他疾病的早期基因检测具有成本效益。WES和基因panel的结果现在可以在几个星期内获得，与一些内分泌测试相当，允许基因测试成为一线方法，可以在诊断过程中提前预定，该检测昂贵并且可能是侵入性的、表型的探索和发现共患病。外显子组（2天内的结果）诊断危重新生儿（包括综合征DSD，如CHARGE、Kabuki或Noonan综合征）的可行性和有效性已在各种设置中得到证明和实施。对于DSD基因panel，大多数设施提供2-3周的周期，一旦排除了危及生命的肾上腺功能不全就可以了。
利用诊断改善护理
以患者为中心的护理的一个关键方面是诊断准确性，它提供了避免不当治疗、根据具体情况调整干预措施和改善结果的手段。例如，许多个体接受了部分AIS的工作诊断，即发育过程中组织对睾酮的反应受损导致46，XY个体出现非典型外生殖器。然而，只有少数疑似新发部分AIS病例的AR基因中实际发现了突变。那些被误诊的病例可能携带SRD5A2、NR5A1/SF1或LHCGR突变，这些突变可以部分模拟部分AIS。因此，在决定治疗方案之前获得分子诊断至关重要，因为雄激素治疗的反应可能因基因突变而大不相同。
需要大规模登记
由于每个DSD病例都很少见，而且最佳方案往往不明确，因此需要大型登记处来获取纵向临床数据，以及已知的分子变异。这些登记需要包括表现和自然史，以及激素或手术干预（或不干预）对性别认同、性功能、心理社会结果和生活质量的影响。
结论：DSD是儿科内分泌学和泌尿学的一个高度专业化的亚专业，由于成功的宣教工作，人们对DSD的认识正在不断提高，这些宣传工作使DSD患者自身面临的问题放在了重要恰当的位置。然而，就全球范围，人们对DSD仍然没有得到充分认识，一些DSD患者继续面临尴尬和社会歧视。