二代测序（NGS）技术利用很少量的核苷酸，就可以进行突变、拷贝数变异和融合事件等的多基因检测，目前 NGS 的飞速发展与临床应用，以循环肿瘤 DNA（ctDNA）等为检测对象的液体活检技术已成为肿瘤研究领域的热点之一 [1]。
图源：参考文献 11
随着生活水平的提高，物质的丰富化，结直肠癌（CRC）的发病率越来越高，而且，在世界范围内，CRC 已经是继肺癌之后，排名第二的肿瘤死亡相关的癌种 [2]。随着药物的发展，化疗、靶向、免疫治疗等都相继应用于 CRC 中，但是，不可避免的，治疗后的复发、转移仍会出现，在当今精准治疗时代，利用肿瘤的分子特征来进行更精准的患者分层越显重要。
因此，目前 ctDNA 测序越来越多地应用于 CRC 患者的临床管理中，NGS 检测预后性体细胞变异可能影响 CRC 的治疗决策 [3]。有研究已发现，CRC 的 ctDNA 分析可用于检测体细胞突变，其频率与其他独立队列中肿瘤样本测序所观察到的频率相当 [4]。
在结直肠癌队列中通过 cfDNA 或肿瘤组织测序进行基因组分析，突变频率呈强正相关（R2 = 0.95,P＜0.0001）
基于 NGS 的术后 ctDNA 检测，可以预测复发风险高的 CRC 患者 [5]。目前转移性 CRC（mCRC）的治疗策略随着分子诊断的改进而发展，随着时间的推移，患者体内的分子异质性可能会导致一线和后续治疗的失败 [6-7]。
mCRC 中的血浆 RAS 突变清除率，越来越多地被用作生物标志物，以筛选可以再次抗 EGFR 治疗的患者 [8]。然而，治疗期间 ctDNA 的基因组异质性，以及其对临床结果的影响仍未知。需要进一步探索 mCRC 相关的、ctDNA 体细胞变异体的时间异质性。
2.
近期，由中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授、王峰教授领衔的研究团队在国际消化道权威期刊《Gut》在线发表了最新研究成果 [9]，他们发现在 mCRC 患者一线治疗过程中，血浆 RAS 和 BRAF 清除率分别为 42.6% 和 50.0%，而循环肿瘤 DNA（ctDNA）中 RAS 和 BRAF 获得率分别为 3.6% 和 0.7%。
血浆 ctDNA 中 RAS 和 BRAF 基因突变状态的改变伴随着临床预后上的显著改变，展示出 mCRC 患者基因突变图谱在时间上的异质性，说明对 mCRC 患者进行 ctDNA 动态监测在预后预测上有重要的临床必要性。
文章封面
徐瑞华教授团队开展的这项前瞻性、观察性队列研究，历时 3 年余，纳入 171 例不可手术切除的 mCRC 患者，在开始一线标准治疗前，收集患者原发肿瘤组织和外周血样本，进行肿瘤组织全外显子测序（63 例）和 ctDNA 378 个基因 panel 测序（171 例），并在治疗后每 6-8 周采集患者的血液样本，进行 ctDNA 测序，同时根据 RECIST1.1 标准进行疗效评估，直到患者出现肿瘤进展。
研究设计与流程图
基线时入组患者的 ctDNA 检测，发现 RAS 突变 74 例（43.3%），BRAFV600E 突变 11 例（6.4%）。
他们首先评估了 63 例患者的配对基线组织和血浆样本，RAS 突变率在肿瘤组织为 46%，在 ctDNA 为 47.6%，而 BRAFV600E 在肿瘤组织为 9.5%，在 ctDNA 为 7.9%，因此，RAS/BRAF 突变状态在血浆和组织显示出良好的一致性 (81.0%，51/63)。
而 RAS 和 BRAFV600E 突变状态分布不一致，分别为 17.5%（11/63）和 1.5%（1/63）。以上数据表明，在基因层面上，肿瘤组织和 ctDNA 的一致性较佳。因此，ctDNA 可以在这个研究中，作为肿瘤基因突变的时间异质性的监测指标。
NGS 检测 ctDNA 378 个基因的突变频率和肿瘤组织的突变频率呈强正相关（R2 = 0.91,P＜0.001）
于是，研究人员对患者进行了 ctDNA 多时间点动态监测，分析得到 ctDNA 的动态高频突变基因频谱。
一线治疗一段时间 (中位 4.67 个月，范围 14.0-14.50 个月) 后，在标准治疗（SOC）靶点基因方面，42.6%(26/61) 的基线 RAS 突变患者治疗后 RAS 突变清除，50.0%(5/10) 的基线 BRAF 突变患者治疗后 BRAF 突变清除，而 3.6%(3/84) 和 0.7%(1/135) 的患者治疗后检测 ctDNA 出现新的 RAS 或 BRAF 突变。
在大多数患者中，用于临床试验的相关靶点基因，如 ERBB2 扩增、NTRK 融合和其他 (包括 KRAS G12C、BRAFnonV600E、PTEN、NF1、MTOR、MET、CDK12、CDKN2A、FGFR1/2/3) 随着治疗时间的推移，突变状态大部分都保持一致。上述基因突变的状态改变率为 12.4%（18/145）。
入组患者一线治疗后，血浆 ctDNA 体细胞突变图谱变化显示 CRC 基因异时性
以上证据表明，肿瘤的基因表达会因为治疗用药而发生突变状态的转换，那么，在临床预后方面，这种 ctDNA 基因组改变是不是会影响患者的生存结局呢？
徐教授的团队用数据回答了这个问题。
研究中，治疗后血浆 RAS/BRAF 突变清除的患者，与保持 RAS/BRAF 野生型的患者显示出相似的无进展生存期 (PFS) 和总生存期 (OS)。
其中，RAS 的 mPFS 分别为 12.8 个月 [95%CI 10.2-未达到（NR）]vs. 13.2 个月 (95%CI 10.8-16.4)，mOS 分别为 NR(95%CI 22.7-NR) vs. 31.4 个月 (95%CI 26.0-NR)；BRAF 的 mPFS 分别为 NR(95%CI 18.9-NR) vs. 11.5 个月 (95%CI 10.4-13.3)，mOS 分别为 NR(95%CI 20.8-NR) vs. 26.7 个月 (95%CI 22.7-NR)。
与治疗过程中持续保持 RAS/BRAF 突变状态的患者相比，治疗后血浆 RAS/BRAF 突变清除的患者预后显著提高（下图）。
按照治疗后血浆 RAS 突变状态改变分层的 Kaplan-Meier 生存曲线
然而，治疗后出现新 RAS/BRAF 突变的患者，与治疗过程中持续保持 RAS/BRAF 突变状态的患者的预后相似，mPFS 分别为 6.1 个月和 8.7 个月，PFS 和 OS 都比保持 RAS/BRAF 野生型的患者要显著缩短。
简而言之，血浆 RAS 或 BRAF 突变状态的改变与生存预后的变化显著相关。
按照治疗后血浆 BRAF V600E 突变状态改变分层的生存曲线估算
而在一线治疗失败、疾病进展之后，同样，研究人员也观察到显著的体细胞突变图谱变化。
研究人员在 20 例一线治疗后进展（PD，中位 6.57 个月，范围 1.07-12.2 个月）的患者中，追踪他们的血浆样本突变图谱变化。
在 SOC 靶点基因方面，44.4%（4/9）的患者 RAS 突变清除，没有患者 BRAF 突变清除。而且，有 27.3%（3/11）出现新发 RAS 突变，5.3%（1/19）出现新发 BRAF 突变。而在临床试验的相关靶点基因方面，只有一例患者出现新发 NF1 突变，其他 95%（19/20）的患者并无基因突变状态改变。
PD 后体细胞突变图谱变化
与此同时，研究人员还观察到，相对于基线 (中位最大变异等位基因频率 MSAF, 8.5%; IQR, 2.7%–55.9%; p<0.001) 和 PD（MSAF, 10.4%; IQR, 0.7%–27.9%; p = 0.002）患者的 ctDNA 水平，在最佳缓解状态时，ctDNA 的水平显著降低（中位 MSAF, 0.1%; IQR, 0%–1.0%）。
也就是说，在部分缓解和疾病稳定的患者中，ctDNA 的水平降低，而在 PD 患者中则升高，这提示 ctDNA 检测可以用于疗效评估。这不仅能够部分解释治疗失败的原因，并且也为后续治疗提供了有效信息。
ctDNA 动态改变与疗效评估的相关性
在这个研究中，徐瑞华教授团队观察到，肿瘤组织标本和配对血浆 ctDNA 样本，有良好的体基因突变一致性。在 mCRC 的系统治疗中，通过 ctDNA 检测体细胞基因变异是一个可靠的手段。今年早些时候，该团队已经证实了术后 ctDNA 可作为 II/III 期 CRC 复发风险标志物 [10]。
3.
在临床中，当怀疑肿瘤进展或复发时，医生往往很难重复进行组织活检，而 ctDNA 这种液体活检技术如果可以有效的替代组织活检，那对于医患双方都是非常有利的。
一方面，相对无创的动态 ctDNA 监测可以指导医生的治疗决策，更好的改善患者预后；另一方面，相对于重复多次的手术活检，仅仅抽血就能解决掉病情复发监测这个难题，对于患者本身也是重大利好的，医从性也将更好。
这个研究最有趣且与临床相关的发现是，血浆 RAS 或 BRAF 基因体细胞突变状态的改变，伴随着临床预后的急剧改变，从 RAS/BRAF 突变型转变为野生型的患者的疗效和生存得到显著提高。
也就是说，初始体细胞突变状态在预后分层和治疗决策中，可能并不太可靠。相反，序列的、实时的突变状态可能对治疗疗效和患者生存有更大的影响。这项前瞻性、序列的 ctDNA 分析研究揭示了 mCRC 的基因组时间动态性和异质性，并为支持使用 ctDNA 测序捕获动态体细胞突变谱，以及预测 mCRC 患者预后等方面，提供了宝贵的数据和有力的证据。