2019年，Broad研究所刘如谦（David R. Liu）教授在Nature杂志发文，开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editor），这种方法融合了工程逆转录酶和Cas9，将新的遗传信息直接写入到靶向DNA位点，从而使用Prime编辑导向RNA进行编辑。

时隔两年，其研究组再次发文，分别在Cell和Nature Biotechnology杂志上发表了关于先导编辑的进一步研究成果。

Prime Editor是一种精确的基因编辑方法，有可能纠正绝大多数已知致病基因变异。研究人员可以利用启动编辑技术在人类细胞和动物的目标部位进行DNA替换、插入和删除。然而，编辑效率取决于被编辑细胞的类型和基因组中的目标位置。

为了进一步开发这项技术，麻省理工学院和哈佛大学Broad 研究所的科学家们对先导编辑系统的一个关键组成部分进行了改进，该系统被称为先导编辑引导RNA (prime editing guide RNAs，pegRNAs)， pegRNAs负责编码预期的编辑并指导先导编辑机制。

在Nature Biotechnology杂志上的这篇研究中，研究人员表明，pegRNAs可以在细胞中降解，导致截断的pegRNAs干扰启动子编辑。他们开发了新的pegRNAs，可以防止细胞降解，大大提高了编辑效率。

在今天发表在Cell杂志上的第二项研究中，Broad的研究人员与普林斯顿大学、加州大学旧金山分校的科学家合作，确定了限制编辑效率的细胞途径，并利用这些发现开发了新一代素编辑系统。

两项研究的研究人员都证明，新的系统可以更有效地编辑与阿尔茨海默病、心脏病、镰状细胞和朊病毒疾病、2型糖尿病和其他疾病相关的突变，同时产生更少的不想要的副产品。

“这些改进的初始编辑效率和产品纯度将许多编辑从一个可能用作研究工具的体系，带到一个可能作为治疗手段的体系，”Broad研究所梅金医疗改革技术研究所主任Richard Merkin说。

设计一个更稳定的导向系统

先导编辑允许科学家纠正绝大多数已知的致病突变，包括数十个碱基对的替换、插入或删除。与其他一些基因组编辑技术不同的是，先导编辑并不需要切断两条DNA链，因此减少了不必要的编辑结果或不必要的细胞反应的机会。目前，数百个研究小组正在利用这一编辑技术研究和纠正水稻、小麦、斑马鱼和小鼠等多种生物体的突变。

在2019年首次描述了这一编辑技术之后，刘如谦团队继续开发这项技术。在Nature Biotechnology杂志的研究中，他们发现pegRNA存在降低效率的弱点。他们发现pegRNA末端编码编辑的长链RNA容易被细胞酶降解。降解的pegRNA不能介导素编辑，也不能通过阻止完整的pegRNA访问目标位点来“毒害”编辑系统。

研究人员接下来寻找可以添加到pegRNA中的保护结构。他们测试了几种不同的RNA序列，确定了折叠成结状结构的序列，保护它们不受RNA降解酶的影响。当他们将pegRNA修改为包含结点和连接序列时，他们观察到启动子编辑效率大幅提高，这表明新的结构保留了RNA模板进行编辑。

研究人员在一系列哺乳动物细胞系中使用工程pegRNA，或称epegRNA，发现epegRNA平均将启动子编辑效率提高了三到四倍，在启动子编辑更困难的细胞系中取得了更大的改善。

引导细胞

在Cell的研究中，这一团队和他们的合作者设计了先导编辑系统的蛋白质成分，进一步提高效率，并最大限度地减少包括患者细胞在内的多种细胞类型产生的副产物。

研究人员旨在更全面地了解决定先导编辑结果的细胞因子，以便设计更有效的系统。研究小组怀疑，某些细胞蛋白质在启动编辑过程的关键部分(当细胞修复启动编辑器生成的DNA分子时)中活跃，可能会阻碍甚至反向编辑，并增加不必要的副产物的产生。

为了验证这一假设，研究人员与普林斯顿大学的Britt Adamson和Jonathan Weissman合作，利用基于CRISPR干扰的筛选技术，系统地研究了先导编辑关闭476个不同DNA修复基因中的每个基因的效果。

基于这些结果，研究人员专注于一种称为错配修复的过程，该过程在细胞中自然发生，纠正在DNA复制和修复过程中产生的DNA错配。他们发现错配修复干扰了启动编辑，降低了编辑效率，并增加了非预期插入或删除的比例。

基于这一观点，该团队开发了新的先导编辑系统，他们称之为PE4和PE5，其中包括一种蛋白质，MLH1dn，研究人员设计它暂时抑制错配修复的一个组成部分。研究人员发现，在发生错配修复的细胞中，PE4和PE5大大提高了编辑效率，与现有的先导编辑系统相比，产生的副产物要少得多。

最后，科学家们发明了PEmax，优化了先导编辑机制的结构和氨基酸序列。结合PE4和PE5系统、PEmax和epegRNAs的改进，与现有系统相比，编辑效率提高了10到100倍。

Adamson说:“通过结合不同研究小组的专业知识，我们能够弄清楚先导编辑是如何工作的，并优化系统的部分。”“这项研究是基础理解如何推动实验设计的一个美妙例子。”

治疗应用

刘教授说，在许多情况下，epegRNAs和PE4/5/max的结合改进使科学家更容易创建疾病的细胞模型，这是开发治疗方法的关键一步。

该团队目前正在使用这些系统来治疗细胞和动物遗传疾病模型，并将继续探索这些系统的基本生物学特性。

“所有这些创新都是协同的，”刘教授说，“通过这些改进，我们能够高效和清洁地编辑重要的细胞类型，也许有一天可以帮助那些患有遗传成分疾病的患者。”这些发现也表明，还有其他策略可以进一步改善先导编辑。”

参考文献

Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency