由于未甲基化的 C 会转变为 T，这种转变会让基因组内的 C 相对变少，ATG 相对变多了；
而对于正常基因组的测序而言：
正常构建的文库，应该是碱基平衡的文库，也就是说，A/C/G/T 四种碱基的比例，各占 25% 左右；
只有这样，测序仪对碱基的判读才会更准确。如果缺少了一种或者几种碱基，测序仪对碱基的判读就会出现问题。测序得到的数据质量就会下降。
而甲基化文库中经过亚硫酸氢盐处理，绝大多数的 C 都变成了 T。所以，这个文库中是严重地缺少 C 碱基的，也就是四种碱基的比例是严重不平衡的。
这时候再来测序，得到的数据质理就较差。
这就是 BS-Seq 与常规转录组相比存在的问题之一。
面对甲基化测序，我们经常需要思考与解决的问题。
其一是如何将甲基化和其他突变同时测序，通过一份样本，提供更全面的基因信息，即“合”则“多”，“多”的价值无需赘言，毕竟，能减少样本量，少抽血少送片，就是提升了产品的终端竞争力；
另一个是如何更精确的区分不同的甲基化模式，即“分”则“少”，“少”不是“能力不足”，而是“更精准”，因为羟甲基化，来源于甲基化，使命却是终结甲基化，唯有准确区分，分而测之，是相关方法学创新的焦点问题。
我们以两篇文献为引，且作管中窥豹。
第一篇
01
是 2023 年 2 月发表于 PNAS 上的一篇文章[1]，可以实现在同一模板 DNA 中检测罕见突变，拷贝数变异和甲基化。
作者开发了一种名为 MethylSaferSeqS 的方法，可以应用于任何适合大规模平行测序的标准文库制备方法。
其创新步骤是用引物复制每个 DNA 条形码分子的两条链，然后将原始链(保留其 5-甲基胞嘧啶残基)与复制链（其中 5-甲基胞嘧啶残基被未修饰的胞嘧啶残基取代)分离。这样就可以分别从原始链和复制链中获得 DNA 分子中存在的表观和遗传改变。
MethylSaferSeqS 方法的主要步骤：
1. 在接头连接后，复制每个模板 DNA 分子的两条链
2. 将原始 DNA 链与复制的 DNA 链进行分离
3. 构建两个文库，一个来自原始 DNA 链 (a)，一个来自复制链 (b)：
a. 使用亚硫酸氢盐对原始链中未修饰的胞嘧啶残基进行脱氨基处理，然后进行 PCR 扩增，并评估表观遗传学变化；
b. PCR 扩增复制链，评估基因型变化；
看似很简单，但其中有两点至关重要。
第一
修改 adaptor 序列，以确保与标准文库制备和测序方法兼容。通过对模板分子上的 adaptor 进行修改，使亚硫酸氢盐介导的脱氨基作用不会改变 adaptor 序列。
在 adaptor 序列中用 5-甲基胞嘧啶 (5-meC) 取代胞嘧啶 (C) 残基。或者，adaptor 也可以有其他改变形式,比如只使用 A、T 和 G，而不使用任何 C。
第二
由于异常基因变化或表观遗传学变化在某些 cfDNA 样本中是非常罕见的，因此在文库制备过程中需要避免这些等位基因的丢失，得到更多的模板分子。
我们将 MethylSaferSeqS 方法的重要步骤和细节点拆解如下：
步骤 1：复制模板分子，这一步是与传统文库制备方法的主要区别。
在传统的文库制备过程中，一旦 adaptor 体连接到 DNA 模板上，就会使用 PCR 扩增文库，以获得足够的DNA用于目标富集。然而,一旦进行扩增，DNA 模板的所有共价修饰（如甲基化或羟甲基化）都会丢失，并在复制过程中被未修饰的 DNA 残基取代。
而在 MethylSaferSeqS 中，两条 DNA 链会像典型的 PCR 步骤一样被热变性，但随后每条链都会被含有双生物素修饰和 5' 端脱氧尿苷（dU）的单引物复制。由于这一步每个反应只使用一个引物而不是两个引物，因此不会出现指数扩增。在复制之后，会产生 n+1 条链，而不是 2n 条链 (n= PCR 循环的次数)
步骤 2：分离复制链和原始链。
如上所述，用于复制的引物在5' 端含有双生物素修饰和一个 dU。5' 双生物素修饰可使复制链（仍与原始链杂交）与链霉亲和素磁珠结合，并确保这种相互作用不会被热破坏。结合后，原始链通过热变性与磁珠和结合的复制链分离。
最后，利用尿嘧啶 DNA 糖基化酶和 DNA 糖基化酶-裂解酶 EndonucleaseVIII 在 dU 残基处进行裂解，将剩余的复制链从磁珠上去除。从磁珠上去除 DNA 模板是因为作者发现，对于后续文库构建，在溶液中扩增比在磁珠上扩增更有效。
步骤 3a：使用亚硫酸氢盐对原始链中未甲基化的胞嘧啶进行脱氨基处理。
主要对温度和时间进行了优化，提升转化效率和得率，不做详述。另一个需要关注的点是，亚硫酸氢盐处理文库的扩增，与步骤 3b 相比有一个重要区别：用于 PCR 的引物较短，因此，只有具有甲基化 adaptor 的原始分子才会与引物序列保持同源性，并选择性地进行扩增。
步骤 3b：对复制的链进行 PCR 扩增。
该步骤与基本的 SaferSeqS 方案相同。在这一步中，使用针对每个 DNA 片段末端适配序列的引物进行扩增
这三个步骤结束后会产生两个文库：一个文库来自复制的分子，用于评估基因变异（如突变和拷贝数变化）；另一个文库来自原始分子，用于评估DNA甲基化 。
作者用该方法，对 265 名患者的血浆样本进行测序分析，其中包括 198 名胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌患者，发现了预期的突变、拷贝数改变和甲基化模式。
MethylSaferSeqSh 巧妙地实现了原始 cfDNA 序列和复制后序列的分离和分别 PCR 扩增，避免了扩增后序列甲基化信号丢失的问题，实现了遗传学和表观遗传学双组学标志物的联合分析。
BS-Seq 存在的另一个问题，则是无法区分 5mC 和 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC)。
而这两种甲基化模式，对基因表达的调控作用又完全不同：启动子区的 DNA 甲基化对基因表达有抑制作用，而 DNA 羟甲基化则会促进基因的表达；也就是说 5mC 和 5hmC 在功能上，其实经常是相互间拮抗的。
第二篇
02
是 2023 年 8 月发表于 Nature Chemical Biology 上的一篇文章[3]，对 BS-Seq 做了改进，实现了对 5mC 和 5hmC 的准确解析。
当然，这并不是第一种可以准确解析 5mC 和 5hmC 的测序方法。
氧化亚硫酸盐测序 (oxBS-Seq) 法，也能实现这一目标。
其原理是将传统的 BS-Seq 技术与化学氧化相结合，先利用高钌酸钾将 DNA 上的 5hmC 氧化成 5fC，再用重亚硫酸盐处理，5fC 和没有任何修饰的 C 就被转化成 U，而 5mC 则不会被转化，仍然保持为 C。因而可以特异性的检测 5mC。
但是，它有一个小缺点，那就是 DNA 需求量较大，一般为微克（μg）级 DNA；
而 Nature Chemical Biology 的这篇文章，使用纳克级 DNA，并且在测序覆盖范围和 5mC 的准确定量方面优于 BS-Seq。
这种方法称之为 DM-Seq。
采用了两种关键的 DNA 修饰酶：一种是新 DNA 甲基转移酶，另一种是能够精确区分胞嘧啶修饰状态的 DNA 脱氨酶。将这些活性与脱氨酶抗性 adapter 偶联，可以通过测序中的 C-to-T 转换直接准确检测 5mC。
整体而言，该方法的创新之处主要是两点，一是酶，一是 adapter；
首选说酶
研究团队筛选了一系列的工程化甲基转移酶（MTase*）以及其底物 SAM，试图找到一种能够将保护基团有效地转移到未修饰的 CpG 上，并完全保护新生成的修饰碱基不受 A3A 介导的脱胺作用的影响的胞嘧啶。结果发现 5-羧甲基胞嘧啶（5cxmC）具有尺寸和负电荷的特征，作为抗 DNA 脱氨酶 APOBEC3A（A3A）脱氨的修饰胞嘧啶碱基。
再说 adapter
最初，此方法有一个问题，即 DNA 互补链的 CpG 羧甲基化不完全的问题，因此作者设计了一个 5-丙炔基胞嘧啶（5pyC）adapter，通过 5pyC adapter 实现的拷贝链合成克服了不对称 DNA 羧甲基化的挑战。
在最终的 DM-Seq 工作流程中， 5pyC adapter 连接到 gDNA 片段上并复制以产生一条只含有 5mCs 的链来代替 C，然后 gDNA 被 CxMTase (作用于未修饰的 CpGs) 和 βGT 的糖基化 (用于 5hmCs) 所保护。在 PCR 扩增和测序之前进行 A3A 脱氨。
当然，一个创新方法的性能究竟如何，需要和经典方法进行比较，我们看看 DM-seq 和 BS-seq 的比较数据。
首选看上样 DNA 量，从下图A可以看到，通过定量 PCR (qPCR) 检测，DM-Seq 样品的可扩增 DNA 含量是 BS-Seq 样品的 22 倍，意味着 DM-seq 可以检测样本量更少的核酸样品 (Ct：17.0 vs 12.5)。
未修饰的噬菌体 gDNA 的全基因组比较结果中，BS-Seq 的 CpG 不转化率低 (0.23%)，而 DM-Seq 的脱氨保护率高 (96.7%)，验证了复制链流程将 CpG 转化为 5cxmCpG 的效率。
用 M.SssI 处理的 gDNA 样本中，91.3% 的 CpGs 被 BS-Seq 保护；而在 DM-Seq 中，93.1% 的 CpGs 被 A3A 脱胺。在 M.CviPI MTase 条件下，BS-Seq 和 DM-Seq 在全基因组水平上检测到的 5mCpG 相似 。
以上结果均表明 DM-Seq 能够在单基分辨率下精确检测 5mCpG。
DM-Seq 提供了一种全酶、无损、可靠和直接的方法来单独读取 5mC，可以更好地确定单独 5mC 的生物学功能。
参考文献：
[1] Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Apr 11;120(15):e2220704120. doi: 10.1073/pnas.2220704120. Epub 2023 Apr 4.Detection of rare mutations, copy number alterations, and methylation in the same template DNA molecules
[2] BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program; BMC Bioinformatics. 2009 Jul 27;10:232.doi: 10.1186/1471-2105-10-232.
[3] Nat Chem Biol. 2023 Aug;19(8):1004-1012. doi: 10.1038/s41589-023-01318-1. Epub 2023 Jun 15.
Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution